Unidad de determinación y diagnóstico experimental por mirnas

Descripción

Resumen

Los miRNAs son RNAs de pequeño tamaño (22-25 nt) codificados endógenamente capaces de reconocer RNAs mensajeros y así regular negativamente la expresión de proteínas, dentro de complejos de silenciamiento inducido (RISC) por complementaridad total o parcial con su mRNA diana a través de una pequeña secuencia central (seed sequence). En humanos se han clonado ya más de 800 y predicciones bioinformáticas indican que todos ellos pueden controlar la expresión de más del 30% del total de proteínas. Su función es esencial en una amplia variedad de procesos incluidos el desarrollo embrionario, la respuesta a estrés o la regulación estricta de procesos fisiológicos y por tanto, el mantenimiento de la homeostasis de los organismos. Es importante destacar que el perfil de expresión de miRNAs es específico de tipo celular y puede cambiar dependiendo del estímulo, de tal forma que el contexto celular particular de un mismo miRNA determinará su función en un tipo celular específico.

Por ello, la desregulación de algunos miRNAs se ha señalado entre los mecanismos responsables del desarrollo de patologías como el cáncer, la autoinmunidad, la diabetes, patologías vasculares o diversas nefropatías y se están constituyendo como biomarcadores precisos diagnósticos y de la evolución (pronóstico) de muchas de ellas. Por otro lado, se ha demostrado además, que estos miRNAs junto a mRNAs pueden ser secretados o intercambiados por las células en forma de micropartículas (microvesículas de plaquetas; exosomas de células tumorales; ectosomas de neutrófilos o unidos directamente a proteínas del complejo RISC como Argonauta 2, demostrando gran estabilidad, aún en condiciones muy agresivas. Así pueden ser detectados en medios extracelulares y fluidos corporales como sangre, orina o líquido pleural. De hecho, se estima que la sangre periférica de individuos sanos puede contener una concentración entre 5-50 ug/ml de micropartículas, que incrementaría en caso de pacientes con diversas patologías.

Dado que la desregulación de miRNAs puede causar diversas patologías, éstos están empezando a ser considerados como nuevas dianas de actuación terapéutica. De hecho, se han desarrollado herramientas para modular su expresión: pre-mirs para sobrexpresarlos y antagomirs (anti-mirs) para inhibirlos, con resultados muy esperanzadores en diversos modelos experimentales in vitro e in vivo, incluso de forma experimental también en humanos.

Equipamiento/ Know-How del grupo relevante

El grupo cuenta con equipamiento apropiado y suficiente para la determinación de

miRNAs por qRT-PCR e hibridación in situ:

  •  Campanas pre-PCR
  •  Termocicladores (Life Technologies) para RT
  •  Termociclador Lightcycler 480 (Roche) para amplificación
  •  Software apropiado para el análisis de datos
  •  Hibridador (Dako)
  •  Equipamiento de inclusión en parafina y microtomos
  •  Sala de cultivos celulares
  •  Microscopio de campo claro y fluorescencia
  •  Equipamiento básico para técnicas de Biología Molecular y Celular

 

Aplicaciones

  •  Estudios de caracterización de miRNAs en modelos experimentales in vitro e in vivo.
  •  Identificación y validación de miRNAs como biomarcadores diagnósticos, pronósticos y de respuesta a tratamiento en diferentes patologías.

Ventajas

El grupo de investigación que sustenta esta Unidad de determinación y diagnóstico experimental por miRNAs, lleva poniendo a punto y desarrollando los métodos de determinación de miRNAs desde el año 2005. No sólo ha establecido protocolo de extracción de RNA de diferentes tipos de muestras y su amplificación por qRT-PCR así como su localización por Hibridación in situ, sino que ha desarrollado todos los protocolos de análisis de datos, incluído los estudios de significancia estadística. Por otro lado, el grupo cuenta con amplia experiencia en el manejo de modelos in vitro, modelos in vivo en roedores y manejo de muestras huamanas (tejido, sangre, orina).

Además de las determinaciones de miRNAs, el grupo tiene experiencia en el estudio del significado biológico de estas moléculas, mediante su modulación por pre-miRs y anti-miRs en modelos expeirmentales y la identificación de sus dianas en estos mismos modelos.

Se ofrece un estudio integral de identificación y caracterización de miRNAs en cualquier sistema. El grupo trabaja con reactivos y en colaboración con Exiqon, compañía de referencia en estudios de miRNas a nivel mundial. El grupo de investigación tiene varias patentes ya aprobadas a nivel nacional y en fases internacionales así como otras solicitudes de utilización de miRNAs como biomarcadores diagnósticos y pronósticos en patologías renales y cáncer, así como publicaciones y comunicaciones a Congreso destinadas a la caracterización de miRNAs en modelos in vitro (Aguado-Fraile et al., Plos One 7(9): e44305.)

Servicios ofertados

 Determinación de miRNAs en cualquier tipo de muestra: cultivos celulares, tejidos (frescos y parfinados), fluidos corporales (sangre, orina, líquidos de preservación de órganos), provenientes de modelos animales y pacientes con distintas patologías.  Cuantificación por qRT-PCR y localización por Hibridación in situ. Modulación por pre-miRs y anti-miRs en modelos celulares in vitro.   Estudios de funcionalidad de miRNAs mediante identificación de dianas de mediante bases de datos y confirmación en modelos celulares in vitro.